Как делают допинг-контроль + список запрещенных препаратов

О том, какая непростая задача стоит перед химиками-аналитиками во время спортивных соревнований, рассказывает заместитель директора, заведующий лабораторией хромато-масс-спектрометрических методов анализа ФГУП «Антидопинговый центр», кандидат химических наук Тимофей Геннадьевич Соболевский.

В мире делается огромное количество антидопинговых проб, причем не только во время соревнований, но и между ними. Какие пробы берут у спортсменов и с какими проблемами сталкиваются при этом химики?

Наш ФГУП «Антидопинговый центр» анализирует около 15 000 проб мочи и около 4000 проб крови в год. Большую часть веществ из списка запрещенных препаратов определяют именно в пробах мочи. Впрочем, за последние десять лет все чаще берут и анализ крови, поскольку только так можно проверить, делали ли спортсмену переливание крови, а также определить уровень гемоглобина, гематокрит, концентрацию эритроцитов и другие параметры, которые предполагает программа «Биологический паспорт спортсмена».

Гормон роста, некоторые виды эритропоэтина и инсулинов также определяют исключительно в сыворотке крови. Сегодня некоторые антидопинговые лаборатории проводят исследования, цель которых — продемонстрировать, что анализ крови может быть исчерпывающим и по нему можно определить все. Но поскольку кровь все-таки отбирать сложнее (для отбора нужен специалист с медицинским образованием), да и многие методики придется разрабатывать заново, наверняка и в дальнейшем антидопинговый контроль будет главным образом основан на анализе проб мочи.

Проблем у химиков, работающих в области допинг-контроля, довольно много. За последние десять лет список запрещенных препаратов существенно расширился, появились новые запрещенные классы соединений, для определения которых пришлось разрабатывать и внедрять методики анализа. Понятно, что это требует денег и исключительно высокой квалификации персонала лабораторий.

Вообще система работает следующим образом:

Есть антидопинговые лаборатории, которые анализируют поступающие к ним пробы, а есть национальные и международные антидопинговые организации, планирующие и отбирающие эти пробы у спортсменов, причем как во время, так и вне соревнований. Чтобы инспекторы допинг-контроля могли в любой момент взять пробу, спортсмены международного уровня на несколько месяцев вперед предоставляют информацию о своем местонахождении (на каждый день!). Список веществ, запрещенных во внесоревновательный период, почти вполовину меньше, но в целом допинг-контроль происходит почти непрерывно. Результат анализа лаборатории отправляют в антидопинговые организации, которые делают соответствующие выводы и расследуют нарушения. Лаборатория лишь выявляет присутствие (или отсутствие) в пробах спортсменов запрещенных субстанций и обратной связи со спортсменами не имеет.

Как удается определить такое большое количество самых разнообразных веществ? И какие новые методы для этого предлагают химики?

Это действительно нелегко. Лет десять назад, когда список запрещенных средств был примерно в два раза короче, большинство антидопинговых лабораторий придерживались практики: каждому классу веществ — отдельная линия анализа. Иными словами, отдельно определяли летучие стимуляторы, наркотики, анаболические стероиды, диуретики, бета-блокаторы, кортикостероиды… Из-за большого количества линий анализа было невозможно быстро исследовать много образцов. Чтобы «поймать» небольшие концентрации веществ, пробы приходилось концентрировать. В основном лаборатории сочетали газовую хроматографию с масс-спектрометрией. Для определения веществ в наноколичествах использовали масс-спектрометры высокого разрешения (магнитные секторные анализаторы), а это сложное и капризное в эксплуатации оборудование.

В какой-то момент лаборатории просто захлебывались, поскольку антидопинговые службы, стремясь протестировать как можно больше спортсменов, присылали все больше проб.
Сегодня в лабораториях используют системы, сочетающие высокую эффективность хроматографического разделения (газовая и жидкостная хроматографии) и масс- спектрометрического детектирования. Это так называемые тройные квадрупольные масс-анализаторы (triple quads). Новые приборы с высочайшей чувствительностью и достоверностью определяют, есть ли в образце интересующие нас вещества. Во-первых, это позволяет использовать меньший объем пробы (вплоть до того, что ее можно в несколько раз разбавить водой и напрямую ввести в прибор, если мы говорим о жидкостной хроматографии), а во-вторых, увеличивает количество соединений, определяемых за один анализ. Таким образом, благодаря современному оборудованию методики стали проще и универсальнее, и это заметно увеличило производительность антидопинговых лабораторий.

Параллельно развивались методы подготовки пробы. Если раньше использовали в основном жидкостно-жидкостную экстракцию, которую практически невозможно автоматизировать, то сейчас все чаще применяют твердофазную, в том числе вариант, при котором сорбент с нужными свойствами наносят на поверхность магнитных микрочастиц. Такими частицами очень удобно манипулировать — суспензию добавляют в исследуемый образец, и определяемые соединения сами адсорбируются на их поверхности. Затем пробирку помещают в магнитное поле, которое фиксирует частицы на дне, а остатки пробы выливают. После этого микрочастицы обычно промывают, чтобы удалить нежелательные компоненты, а нужные соединения смывают малым объемом органического растворителя — и все, образец готов к анализу.

Процедура подготовки пробы получается не только простой, но может быть легко автоматизирована. Это своего рода нанотехнология в химическом анализе, и обычно ее используют для поиска в моче или крови веществ пептидной природы, например синтетических аналогов инсулина. Сейчас химики выясняют, можно ли применять этот способ еще и для извлечения низкомолекулярных соединений. К сожалению, метод достаточно дорог, поэтому его применяют не всегда и не во всех лабораториях.

Вообще, антидопинговый контроль ориентирован на определение заданных соединений. При анализе вы увидите только те запрещенные препараты, на которые заранее настроен ваш хромато-масс-спектрометр, а вся остальная информация о пробе теряется. При этом в списке запрещенных веществ во многих разделах есть формулировки: «…и другие вещества со сходным строением или свойствами» или вообще «любые вещества, находящиеся на стадии клинических испытаний и не допущенные к официальному использованию». Чтобы иметь возможность еще раз проанализировать пробу на какие-то другие вещества, не повторяя при этом пробоподготовку, нужно использовать инструментальные методы, которые сохраняют всю информацию о пробе. Такие приборы есть: это времяпролетные масс-спектрометры или масс- спектрометры, работающие по принципу орбитальной ионной ловушки. Они регистрируют все данные (не только заданные) с высоким разрешением, но при работе с такими приборами есть также свои сложности и ограничения. Несмотря на дороговизну, они уже вошли в практику лабораторий – например, у нас в Москве стоит несколько орбитальных ионных ловушек (их называют «Orbitrap»).

Как быстро делается один анализ? Почему иногда спортсмена дисквалифицируют после того, как он уже получил медаль?

Согласно международному стандарту, на анализ отводится 10 рабочих дней. На крупных спортивных мероприятиях, например Олимпийских играх, этот срок составляет 24 часа для проб, показавших отрицательный результат, 48 часов — для проб, потребовавших дополнительного исследования (то есть когда результат скрининга показал наличие запрещенной субстанции), и 72 часа для сложных видов анализа — таких, как определение эритропоэтина или происхождения тестостерона методом изотопной масс-спектрометрии.
Однако в последние годы появилась практика длительного (до восьми лет) хранения проб — чтобы была возможность в будущем, по мере появления новых запрещенных препаратов и методов их определения, провести повторный анализ. Так было, в частности, с пробами Олимпиады 2008 года: больше чем через год после ее окончания их проанализировали на эритропоэтин нового поколения MIRCERA в антидопинговой лаборатории Лозанны, и результат для некоторых спортсменов был неутешительным.

Когда начали проверять спортсменов на использование запрещенных препаратов? Сколько их в списке Олимпиады в этом году?

Первый список запрещенных препаратов Международный олимпийский комитет (МОК) опубликовал в 1963 году, однако тестирование началось лишь пять лет спустя (в 1968-м) — на зимних Олимпийских играх в Гренобле и летних в Мехико. Собственно, история антидопингового контроля началась с того момента, когда стало технически возможным делать подобные анализы массово благодаря активному развитию методов хроматографии и масс-спектрометрии.

Вначале в список запрещенных препаратов входили только стимуляторы, наркотические анальгетики и анаболические стероиды. Со временем туда добавились и другие классы соединений — диуретики, бета-блокаторы, бета2-агонисты, препараты с антиэстрогенной активностью, пептидные гормоны, а также заметно увеличилось количество препаратов внутри каждого класса.

Сейчас в списке запрещенных препаратов, который пересматривают раз в год, около 200 соединений различной природы. Надо отметить, что значительная их часть (например, почти все анаболические стероиды) при попадании в организм человека полностью метаболизирует (модифицируется), поэтому часто лаборатории определяют не сами запрещенные препараты, а продукты их превращения в организме. Это довольно непростая задача — для того чтобы ее решить, надо сначала детально изучить процесс метаболизма, а потом научиться определять наиболее долгоживущие метаболиты. Фактически современный антидопинговый анализ находится на стыке аналитической химии, биохимии и фармакологии.

Подготовка антидопинговой лаборатории к Олимпийским играм начинается задолго до них. Ведь к нужному моменту она уже должна располагать всеми доступными методами и методиками, в том числе и теми, которые еще не вошли в повседневную практику.
В мире вроде бы не так много официально аккредитованных МОК лабораторий, результаты которых он признает. Но при этом наверняка в каждой стране есть и другие лаборатории, которые контролируют своих спортсменов и, несомненно, могут их предупредить, обнаружив какие-то запрещенные вещества.

Тем не менее скандалы случаются. В чем проблема? В спортсменах или в уровне квалификации и степени оснащенности аккредитованных лабораторий, которые определяют меньшие концентрации и больший спектр веществ?

Проводить тестирование спортсменов имеют право только лаборатории, имеющие аккредитацию Всемирного антидопингового агентства (ВАДА). Таких лабораторий сейчас в мире 33, а в России – всего одна – ФГУП «Антидопинговый центр». Международные спортивные организации категорически осуждают содействие спортсменам в употреблении запрещенных препаратов, но существуют данные, что в ряде стран есть лаборатории, работающие не вполне официально. Разумеется, они имеют ограниченный доступ к новым методикам тестирования запрещенных субстанций. Так что совершенно верно: аккредитованные лаборатории умеют больше и лучше оснащены, поэтому обмануть их трудно.

Однако даже эти 33 лаборатории различаются в оснащенности — она сильно зависит от уровня финансовой поддержки со стороны государства. Кроме того, нельзя не учитывать, что некоторые лаборатории получили аккредитацию всего пару лет назад, а другие существуют уже лет тридцать. Поэтому все эти лаборатории формально соответствуют требованиям ВАДА, однако не все одинаково хороши. Кроме того, некоторыми методиками владеют всего одна или две лаборатории в мире. Поэтому допинговые скандалы все еще остаются неотъемлемой частью современного спорта.

Если посмотреть в динамике, то каждую Олимпиаду фиксируется больше или меньше случаев дисквалификации спортсменов из-за допинга? Какова тенденция?

Скорее всего, мы уже прошли через максимум. По мере совершенствования оборудования и методик химического анализа от Олимпиады к Олимпиаде выявляли все больше случаев нарушения антидопингового кодекса. Думаю, что апогей был достигнут в 2004 году. Теперь ситуация меняется к лучшему, равно как и сознательность спортсменов, поэтому организаторы Олимпиады в нынешнем году надеются на «чистые» игры.

Вот тут полный список запрещенных препаратов с названиями

Это список веществ и методов, которые не разрешается использовать спортсменам. Специалисты ВАДА обновляют его каждый год и публикуют на своем сайте www.wada-ama.org. Он состоит из трех разделов: вещества и методы, которые запрещены в спорте постоянно (и во время, и вне соревнований); вещества, запрещенные только на соревнованиях; и, наконец, алкоголь с бета-блокаторами, которые нельзя употреблять в некоторых видах спорта во время соревнований.

Отдельным пунктом Всемирное антидопинговое агентство обращает внимание на использование биологически активных добавок, которые могут быть плохого качества и содержать запрещенные субстанции.

В первом разделе пять классов препаратов и три метода. Первый класс — анаболики, куда входят анаболические стероиды и другие вещества анаболического действия. Эти вещества ускоряют все процессы в организме, стимулируют обновление тканей, их питание и позволяют быстро нарастить мышечную массу. Про андрогенные стероиды (мужские и женские половые гормоны) все понятно — о них рассказывают даже старшеклассникам, в первый раз пришедшим качать мускулы. А вот анаболики нестероидной природы — гораздо более тонкая субстанция. Это могут быть блокаторы и модуляторы отдельных рецепторов (например, препарат кленбутерол, который используют для лечения бронхиальной астмы, в то же время он мощный сжигатель жира и анаболик) и безвредные рибоксин, метилурацил и оротат калия (каждый по-своему и довольно безобидно повышают выносливость и регенеративные способности организма).

Второй класс — пептидные гормоны. Внутри этого класса — несколько групп, в том числе гормоны роста, инсулины, эритропоэтины и прочие вещества, которые повышают мышечную массу и уменьшают жировую, повышают уровень глюкозы, иммунитет, выносливость и даже снижают количество травм.

Следующий большой класс — бета2агонисты, широкий спектр препаратов, которые в медицине применяют при болезнях сердечно-сосудистой системы и астмах. У здоровых людей эти вещества на время повышают устойчивость к физической нагрузке, поскольку расширяют бронхи и помогают открыться «второму дыханию».

Следующий класс — гормоны и метаболические модуляторы, вещества с антиэстрогенной активностью. К последним относится известный противораковый препарат тамоксифен (и ему подобные), который как золотой стандарт назначают при раке груди у женщин. В спорте его комбинируют с анаболическими стероидами, поскольку избыток последних превращается в женский половой гормон эстроген и может «феминизировать» спортсменов (тамоксифен же конкурирует за рецепторы с эстрогеном и не дает ему действовать). С метаболическими модуляторами, а их чрезвычайно много, — все понятно: питание клеток, ускорение метаболизма, выносливость и прочее.

Плюс к перечисленному, само собой, запрещены диуретики и другие маскирующие агенты, позволяющие снизить массу тела и быстро вывести из организма лишние химические вещества. Также в списке ВАДА фигурируют три метода: процедуры, активизирующие перенос кислорода в крови; химические и физические манипуляции с кровью (включая безобидные внутривенные вливания физраствора); и генный допинг, в том числе манипуляции с нормальными и генетически модифицированными клетками.

На соревнованиях нельзя использовать вещества всех категорий из первого раздела, а также стимуляторы (включая капли в нос, содержащие эфедрин), наркотики, каннабиноиды (марихуану, гашиш) и глюкокортикостероиды (снижают воспаление, обезболивают).
Впрочем, спортсмены тоже болеют. Поэтому если заранее подать заявку на конкретное лекарство, обосновав необходимость по всем правилам науки, то можно будет получить разрешение на его прием.

Санкции за нарушение антидопинговых правил варьируют в диапазоне от предупреждения до пожизненной дисквалификации. Если положительный тест приходит во время соревнований, то результаты аннулируют и спортсмена лишают медалей и призов. Все результаты на соревнованиях, проходивших после взятия пробы, также могут быть аннулированы.

По материалам журнала “Химия и Жизнь”